Table des matières
Notes sur les analyses DIY sur OGM
Suite à participation comme intervenant à Fab 14, et rencontre avec avec Guy Aidelberg qui travail sur GMO detetctive
Principe de base
Avec un protocole d'extraction d'ADN de 5 minutes qui ne nécessite que de l'eau. Ceci est couplé à de nouvelles techniques d'amplification de l'ADN isotherme, détectées par fluorescence, en utilisant des LEDs et des filtres en gel plastique ultra abordables. Le premier cas d'utilisation est la détection d'OGM dans les aliments. L'expérience rapide permet à n'importe qui de voir avec les yeux si un gène est présent. Que ce soit dans une école, un biohackerspace ou une cuisine, nous vous encourageons à télécharger, partager et discuter vos résultats avec d'autres personnes à travers le monde. Autonomiser et (de s'auto éduquer les citoyens, tout en permettant la collecte et le partage de nouvelles informations.)
Voir également : Notes de recherche-action sur biononymous & bioprivacy
Manipulations
La manipulations est tehcniquement simple à réaliser et nécessite peu de matériel, peu encombrant.
Le défi principal est le wetware, c'est à dire le matériel biochimique utlisé lors de l'expérimentation.
Compter pour 250 réactions, soit 30 expériences (une réaction LAMP régulière est de 25ul, nous faisons 8x10ul réactions par expérience).
L'amplification isotherme en boucle (LAMP) est une technique à tube unique pour l'amplification de l'ADN1)
Avec Le WarmStart LAMP
Tendre vers un Open wetware est nécessaire mais de très haut niveau.
Wetware
Il s'agit de réactifs et d'ADN (témoins et amorces). Ces sociétés ne vendent généralement pas aux particuliers et les prix baissent drastiquement lors de l'achat en gros.
Mix enzymatique
il s'agit d'un mélange prêt à l'emploi composé d'un brin isotherme amélioré Enzyme ADN polymérase Displaçant l'ADN avec des nucléotides et un tampon qui permettent à la réaction de se produire, tout ce que vous devez ajouter à ceci est un ensemble d'amorces et un échantillon.
pour simplifier est utilisé pour l'instant :
- NEB WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)E1700:https://www.neb.com/products/e1700-warmstart-lamp-kit-dna-rna
Dispo à travers leurs filiales / distributeurs.
Amorces
Chaque jeu a 7 amorces :
- 2 longues amorces internes
- 2 amorces externes courtes
- 2 amorces en boucle pour rendre la réaction plus rapide
- 1 amorce de trempe pour éteindre la fluorescence lorsque la réaction est négative
Les amorces peuvent être commandées chez votre fournisseur local, mais sont moins chères en vrac. Le dessalement standard convient, sauf pour les sondes d'extinction qui doivent être
- HPLCpurifiedIdtdna.com
- Eurofinsgenomics.com
- Thermofisher.com
- Sigmaaldrich.com
COX1 : Amorce de gène de plante
COX1 est commun à toutes les plantes
« COX fait partie d'un complexe d'enzymes qui convertit l'acide arachidonique en prostaglandine H2 (PGH2), le précurseur de tous les prostanoïdes. Le complexe consiste en une isoenzyme COX et une peroxydase. Actuellement on connaît trois isoenzymes COX : COX-1, COX-2 et COX-3. » fr:Cyclooxygénase
Cytochrome c oxidase subunit I Cytochrome c oxidase I (COX1) also known as mitochondrially encoded cytochrome c oxidase I (MT-CO1) is a protein that in humans is encoded by the MT-CO1 gene.[6] In other eukaryotes, the gene is called COX1, CO1, or COI.[7] Cytochrome c oxidase I is the main subunit of the cytochrome c oxidase complex. Mutations in MT-CO1 have been associated with Leber's hereditary optic neuropathy (LHON), acquired idiopathic sideroblastic anemia, Complex IV deficiency, colorectal cancer, sensorineural deafness, and recurrent myoglobinuria
Basé sur : Détection rapide de Phytophthora ramorum et P. kernoviae par extraction d'ADN en deux minutes
Suivi d'une amplification isotherme et d'une détection d'amplicon par un dispositif générique de flux latéral J. A. Tomlinson, M. J. Dickinson et N. Boonhamdoi : 10.1094/ PHYTO-100-2-0143
| Amorce(s) | Sequence 5’to3’ | Modification |
|---|---|---|
| COX F3 | tatgggagccgtttttgc | |
| COX B3 | aactgctaagrgcattcc | 5’ FAM |
| COX FIP | atggatttgrcctaaagtttcagggcaggatttcactattgggt | |
| COX BIP | tgcatttcttagggctttcggatccrgcgtaagcatctg | |
| COX F-Loop | atgtccgaccaaagattttacc | |
| COX B-Loop | gtatgccacgtcgcattcc | |
| COX FIPQ | YCAAATCCAT | 3’ Black Hole Quencher®-1 or Iowa Black® FQ |
Amorces de gènes OGM
Promoteur CaMV-35S commun à la plupart des plantes OGM :
Basé sur : Real-time loop-mediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms ; Fukuta, S., Mizukami, Y., Ishida, A. et al Eur Food Res Technol(2004) 218 : 496.https://doi.org/10.1007/s00217-003-0862-5
| Primer | Sequence 5’to3’ | Modification |
|---|---|---|
| 35S_FIP | aggcatcttcaacgatggccttaaaggaaggtggctcctaca | |
| 35S_BIP | tgccgacagtggtcccaaagttgaagacgtggttggaacg | 5’ FAM |
| 35S_F3 | tgcccagctatctgtcactt | |
| 35S_B3 | tcccttacgtcagtggagat | |
| 35S_FLoop | tcctttatcgcaatgatg | |
| 35S_BLoop | agcatcgtggaaaaagaag | |
| 35S_BIP | QACTGTCGGCA | 3’ Black Hole Quencher®-1 Or Iowa Black® FQ |
Dans chaque réaction de 10ul dans un tube PCR, nous avons à la fin :
- 5ul LAMP mélange réactionnel
- 3ul Mélange d'apprêt
- 2ul échantillon
Guide pour 3x dilutions de mélange d'apprêt (à partir de 50/100 uM) pour différents nombres de réactions :
| Amorce | Amorce working stock conc. | Amorce conc. in10μl LAMP rxn | Vol. of primer (1rxn) μL | Vol. of primer (10rxn) μL | Vol. of primer (50rxn) μL | Vol. of primer (100 rxn)μL | Vol. of primer (200 rxn)μL | Vol. of primer (500 rxn)μL |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FIP | 50μM | 1.6μM | 0.4 | 4 | 20 | 40 | 80 | 200 |
| BIP | 50μM | 1.6μM | 0.4 | 4 | 20 | 40 | 80 | 200 |
| F3 | 50μM | 0.2μM | 0.05 | 0.5 | 2.5 | 5 | 10 | 025 |
| B3 | 50μM | 0.2μM | 0.05 | 0.5 | 2.5 | 5 | 10 | 25 |
| FLP | 50μM | 0.8μM | 0.2 | 2 | 10 | 20 | 40 | 100 |
| BLP | 50μM | 0.8μM | 0.2 | 2 | 10 20 | 40 | 100 | |
| Quencher | 50μM | 2.0μM | 0.6 | 6 | 30 | 60 | 120 | 300 |
| DNase Free H²O | 1.1 | 11 | 55 | 110 | 220 | 550 | ||
| Final volume | 3 | 30 | 150 | 300 | 600 | 1500 |
| Amorce | Amorce working stock conc. | Amorce conc. in 10μl LAMP rxn | Vol. of primer (1rxn) μL | Vol. of primer (10rxn) μL | Vol. of primer (50rxn) μL | Vol. of primer (100 rxn)μL | Vol. of primer (200 rxn)μL | Vol. of primer (500 rxn)μL |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FIP | 100μM | 1.6μM | 0.2 | 2 | 10 | 20 | 40 | 100 |
| BIP | 100μM | 1.6μM | 0.2 | 2 | 10 | 20 | 40 | 100 |
| F3 | 100μM | 0.2μM | 0.025 | 0.25 | 1.25 | 2.5 | 5 | 12.5 |
| B3 | 100μM | 0.2μM | 0.025 | 0.25 | 1.25 | 2.5 | 5 | 12.5 |
| FLP | 100μM | 0.8μM | 0.1 | 1 | 5 | 10 | 20 | 50 |
| BLP | 100μM | 0.8μM | 0.1 | 1 | 5 | 10 | 20 | 50 |
| Quencher | 100μM | 2.0μM | 0.3 | 3 | 15 | 30 | 60 | 150 |
| DNase Free H2O | 2.05 | 20.5 | 102.5 | 205 | 410 | 1025 | ||
| Final volume | 3 | 30 | 150 | 300 | 600 | 1500 |
Réalisation du mastermix
Nous voulons faire assez de mastermix pour X expériences
Chaque expérience est composée de 8 tubes, 4 pour le gène végétal et 4 pour le gène OGM.
Nous mélangeons 5μl*4*X LAMP mix avec 3μl*4*X Primer mix pour chaque ensemble de primaire.
Il est préférable d'en faire environ 10% de plus en cas d'erreur ou de déversement.